Die Theatersammlung bildet mit zahlreichen Rollenbildern, Figurinen, Szenenbildern, Theaterkostümen, (fotografischen) Porträts, Erinnerungsgegenständen sowie Entwürfen für Bühnendekorationen, Kostüme und Theatervorhänge einen der umfangreichsten Bestände des Wien Museums. Sie vermittelt einen lebendigen Eindruck vom Wiener Theaterleben seit dem 17. Jahrhundert, wobei der zeitliche Schwerpunkt der Sammlung im 19. Jahrhundert liegt.
Den Grundstein für die Theatersammlung legte Karl Glossy, ab 1882 Kustos und später Leiter der Städtischen Sammlungen. Über ihn kamen die Wohnungseinrichtung von Franz Grillparzer sowie Erinnerungsgegenstände von Ferdinand Raimund ans Museum. Bald folgten im Auftrag der Stadt Wien angefertigte Aquarelle von Gustav Klimt und Franz Matsch, die das Innere des alten Hofburgtheaters am Michaelerplatz zeigen. Weitere Highlights aus den ersten Jahrzehnten der Sammlung sind ein repräsentatives Gemälde der populären Schauspielerin Charlotte Wolter von Hans Markart sowie ein Ölgemälde der Volksschauspielerin Therese Krones von Joseph Lavos.
Zu den wichtigsten Erwerbungen im 20. Jahrhundert zählen das Schlafzimmer von Johann Nestroy, die Fotoarchive (Szenenfotos) der Presse- und Theaterfotografen Bruno Völkel und Anton Doliwa sowie die Theatersammlung von Fritz Brukner.
Sie besteht aus Grafiken, Zeichnungen und Skizzen des Theatersatirikers Johann Christian Schoeller, Kostümentwürfen von Josef Trentsenky und zahlreichen Porträts berühmter Tänzer:innen, Musiker:innen, Schauspieler:innen, Schriftsteller:innen und Komponist:innen.
Einen Schwerpunkt innerhalb der Sammlung bilden das Musiktheater und hier vor allem die Wiener Operette. Rollenbilder, Porträts und persönliche Gegenstände erinnern an berühmte Darsteller:innen wie Alexander Girardi, Karl Streitmann und Marie Geistinger sowie bedeutende Operettenkomponisten wie Johann Strauss Sohn. Weitere Sammlungsschwerpunkte sind namhaften Tänzer:innen wie Fanny Elßler und Dramatiker:innen wie Marie von Ebner-Eschenbach oder Arthur Schnitzler gewidmet.
Vor allem der Sammlungsbestand der Erinnerungsgegenstände wird kontinuierlich durch Objekte aus dem 20./21. Jahrhundert erweitert, in jüngerer Zeit etwa durch Widmungen der Schauspieler:innen Christiane Hörbiger, Elfriede Ott und Peter Alexander.
