Das Wien Museum besitzt eine bedeutende Gemälde- und Grafiksammlung mit rund 130.000 Objekten aus der Zeit vom 14. Jahrhundert bis zur Gegenwart. Besonders reiche Bestände verzeichnet die Sammlung in der Kunst des Biedermeier, des Historismus, der Zeit um 1900, des Frühexpressionismus sowie der zeitgenössischen Kunst.
Die Tafelmalerei des Mittelalters ist u.a. mit einem Altartafelensemble des Meisters des Wiener Neustädter Altars vertreten, die europäische Renaissancemalerei mit Lucas van Valkenborchs „Kaiserlichem Waldspaziergang vor dem Schloss Neugebäude" (um 1590/93). Im Bereich des österreichischen Barocks und Klassizismus beinhaltet die Sammlung Werke von zentralen Künstlern wie Paul Troger, Johann Michael Rottmayr oder Heinrich Friedrich Füger.
Mit Hauptwerken von Ferdinand Georg Waldmüller, Peter Fendi und Friedrich von Amerling besitzt das Wien Museum eine der wichtigsten Sammlungen der Wiener Biedermeiermalerei. Im Bereich der Grafik ragen vor allem rund 170 Aquarelle und Zeichnungen von Rudolf von Alt heraus. Die Malerei der Ringstraßenzeit ist unter anderem mit hochrangigen Werken von Hans Makart vertreten. Arbeiten von Emil Jakob Schindler und Tina Blau repräsentieren die Landschaftsdarstellung des österreichischen Stimmungsrealismus im ausgehenden 19. Jahrhundert.
Die Kunst der Jahrhundertwende („Wien um 1900"), die nicht zuletzt durch die 1985 vom Wien Museum veranstaltete Ausstellung „Traum und Wirklichkeit“ international neu entdeckt wurde, bildet einen weiteren Schwerpunkt der Sammlung. Gustav Klimts Porträt von Emilie Flöge (1902) sowie 400 seiner Handzeichnungen gehören hier zu den Highlights, ebenso auch bedeutende Werke von Egon Schiele (z.B. „Junge Mutter“, 1914), Carl Moll, Richard Gerstl und Max Kurzweil. Im Bereich der künstlerischen Druckgrafik gibt es einen hervorragenden Bestand von Postkarten der Wiener Werkstätte und Plakaten der Secession.
Zu den bedeutendsten Werken aus der Zwischenkriegszeit gehören Oskar Kokoschkas „Wien vom Wilhelminenberg" (1931) und Herbert Boeckls „Anatomie" (1931). Nach 1945 weist die Sammlung eine hohe Dichte an wichtigen Werken führender Künstler:innen auf. Highlights der „Wiener Schule des Phantastischen Realismus“ (wie Rudolf Hausner), der feministischen Avantgarde (Renate Bertlmann, Margot Pilz) und Pionier:innen der neuen Medien (wie Zelko Wiener, Robert Adrian X) sind ebenso zu finden wie Hauptwerke von Friedensreich Hundertwasser, Arnulf Rainer oder Maria Lassnig. Von Siegfried Anzinger bis Heimo Zobernig bildet die Sammlung die starke Wiener Szene umfassend ab. Sie wird laufend erweitert und vor allem mit Positionen der Gegenwartskunst ergänzt.
